NR AUTE
AU Birkmann,E.
TI Nachweis einzelner pathologischer Proteinaggregate mit der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie als diagnostische Methode für BSE und Scrapie
QU Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, vorgelegt von Eva Birkmann aus Korschenbroich, Düsseldorf 18.7.2005
IA http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=977225194&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=977225194.pdf
PT Inaugural-Dissertation
AB
Prionkrankheiten sind eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen, die sowohl infektiös als auch sporadisch oder genetisch bedingt sein können. Die Erreger sind proteinartige ohne Nukleinsäuren, deren Hauptbestandteil das Prion-Protein (PrP) ist. Das PrP kann in der zellulären Isoform (PrPc) und der pathogen-assoziierten Isoform PrPsc vorliegen, wobei PrPsc Hauptbestandteil des Erregers ist. Die drei einzigen Charakteristika, die streng mit dem Pathogen assoziiert sind, sind Infektiosität, der ß-Strukturanteil des PrPsc und der Aggregationszustand des PrPsc. Die Infektiosität ist aufgrund der langen Zeitdauer von Bioassays als diagnostischer Marker nicht geeignet. Alle bisher zugelassenen BSE-Diagnostik-Methoden beruhen auf dem Nachweis des Proteinase K resistenten Teils des PrPsc (resPrPsc) und können BSE erst im fortgeschrittenen Krankheitsstadium nachweisen. Da jedoch z.T. große Anteile des pathologischen PrPs PK sensitiv sind (senPrPsc), ist die PKResistenz als diagnostischer Marker nicht uneingeschränkt geeignet.
Ziel dieser Arbeit war es daher, ein Verfahren zu entwickeln, welches sich zur Diagnose von Prion-Krankheiten insbesondere BSE besser eignet und das Potential einer Frühdiagnose oder sogar eines Lebendtest verspricht. Dazu eignet sich der Nachweis des Aggregationszustandes des PrPsc. Als Nachweismethode für Aggregate in Lösung stand die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zur Verfügung.
Als erster Schritt war die Isolation vom PrPsc bzw. PrPBSE ohne den Einsatz eines proteolytischen Schrittes nötig. Zur Isolation von PrPsc aus Hamsterhirngewebe war die Methode der NaPTA-Fällung bekannt (Safar et al., 1998). Sie basiert auf einer selektiven Fällung von PrPsc-Aggregaten, während monomeres PrPc im Überstand verbleibt. Anhand dieser Methode wurde ein Aufreinigungsprotokoll für PrPsc aus Hamsterhirn etabliert, welches durch die Einführung geeigneter Waschschritte die Isolation von PrPsc mit einem hohen Reinheitsgrad ermöglichte. Dieses Protokoll wurde anschließend auf die Isolation von PrPBSE aus Rinderhirn übertragen.
Als Sonden zum Nachweis von PrPsc mittels 2D-FIDA eignete sich die Antikörperkombimation D13 und R1, für PrPBSE Saf32 und 12F10. Mit der Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern und einer zwei Wellenlängen-Optik im FCS konnten sowohl mit Scrapie infizierte Hamster als auch mit BSE infizierte Rinder signifikant von gesunden Kontrollgruppen unterschieden werden. Da PrPAggregate in Suspension jedoch nicht gleichverteilt vorliegen, ließen sich enorme Standardabweichungen zwischen Messungen der gleichen Probe nicht verhindern. Daher wurde eine neue Analysestrategie entwickelt. Diese zielt darauf ab, aufgereinigte Prionaggregate auf der Oberfläche eines Messchips mit Hilfe eines Captures zu immobilisieren und dann durch Abscannen oberhalb der Bodenfläche mittels zwei Wellenlängen-FCS zu detektieren. Diese Methode, SPILA (single particle immuno-sorbant laser-scanning assay) genannt, konnte erfolgreich zur Diagnose von Scrapie und BSE angewendet werden.
Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuartiges Verfahren entwickelt, welches einen hochspezifischen und hochsensitiven Nachweis von Prionen erlaubt und somit erstmalig alle Eigenschaften, welche das Potential für eine Frühdiagnose voraussetzt, vereinigt.
AD E. Birkmann, Universität Düsseldorf, Germany
SP deutsch
PO Deutschland