NR ATCT
AU Heindl,P.; Fernandez Garcia,A.; Büttner,M.; Voigt,H.; Butz,P.; Tauscher,B.; Pfaff,E.
TI Some physico-chemical parameters that influence proteinase K resistance and the infectivity of PrPsc after high pressure treatment
QU Brazilian Journal of Medical and Biological Research 2005 Aug; 38(8): 1223-31
PT journal article
AB Crude brain homogenates of terminally diseased hamsters infected with the 263 K strain of scrapie (PrPsc) were heated and/or pressurized at 800 MPa at 60 degrees C for different times (a few seconds or 5, 30, 120 min) in phosphate-buffered saline (PBS) of different pH and concentration. Prion proteins were analyzed on immunoblots for their proteinase K (PK) resistance, and in hamster bioassays for their infectivity. Samples pressurized under initially neutral conditions and containing native PrPsc were negative on immunoblots after PK treatment, and a 6-7 log reduction of infectious units per gram was found when the samples were pressurized in PBS of pH 7.4 for 2 h. A pressure-induced change in the protein conformation of native PrPsc may lead to less PK resistant and less infectious prions. However, opposite results were obtained after pressurizing native infectious prions at slightly acidic pH and in PBS of higher concentration. In this case an extensive fraction of native PrPsc remained PK resistant after pressure treatment, indicating a protective effect possibly due to induced aggregation of prion proteins in such buffers.
IN
Die Autoren benutzten den an Hamster adpatierten Scrapie-Stamm 263 in homogenisierten Hamstergehirnen, 1 zu 10 verdünnt in einfach konzentrierter PBS-Lösung (Phosphate buffered saline) bei pH-Werten von 5,6 oder 6,4 oder 7,4 oder 7,9. Sie erhitzten diese Homogenate in Proben von je 250 µl auf 60° und setzten sie dem extremen Druck von 800 MPa für 1 Sekunde oder 5, 30 oder 120 Minuten aus. Dabei dauerte es mindestens 2 Minuten, bis sich in einer hydraulischen Presse dieser Druck aufgebaut hatte.
Nach der Druckbehandlung wurden je 15 µl für 1 Stunde bei 37° mit 73 µg/ml Proteinase K inkubiert. Schließlich wurden diese Proben bei 95° denaturiert und in Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt. Im Western blot konnte man dann den Effekt der Hochdruckbehandlung auf die Proteaseresistenz sehen.
Zur Überprüfung der Restinfektiosität wurden Teile der druckbehandelten Proben in Zehnerschritten bis zu 10.000-fach verdünnt und etwa 3-4 Wochen alten Hamstern intrazerebral inokuliert. Die Hamster wurden maximal 270 Tage lang beobachtet. Erkrankte Hamster wurden getötet und in ihren Gehirnen wurde das proteaseresistente PrPsc nachgewiesen. Leider erwähnen es die Autoren weder im Methodenteil, noch bei den Resultaten explizit, aber sehr wahrscheinlich wurden diese Übertragungsexperimente nur mit den Proben unternommen, die auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt waren.
Erhitzung auf 60° allein zeigte selbst nach 2 Stunden keinen Effekt auf die Proteaseresistenz, während der Effekt der Hochdruckbehandlung bei pH 7,4 schon nach 1 Sekunde sehr stark war und sich binnen 30 Minuten noch erkennbar steigerte. Danach war im Western blot kein PrPsc mehr erkennbar.
Die Autoren erklären nicht, wie sie aus den mittleren Inkubationszeiten die für 50% der inokulierten Tiere infektiöse Dosis errechnen. Meines Erachtens müsste es besser lethale Dosis heißen, weil man binnen 270 Tagen sublethale Infektionen gar nicht nachweisen konnte. Irgendwie kommen sie aber zu folgender Tabelle ihrer Ergebnisse bei den Inokulationen von jeweils 1,5 mg Hamsterhirn:
Behandlung Inkubationszeiten Log ID50 (Einheiten/g Hirn)
unbehandelte Kontrolle 82 ± 8 8,4
60°, 30 Min 85 ± 5 8,0
60°, 120 Min 90 ± 6 7,5
800 MPa, 60°, 1 s 115 ± 5 5,1
800 MPa, 60°, 30 Min 134 ± 17 3,5
800 MPa, 60°, 120 Min 170 ± 38 2,0
700 MPa, 60°, 120 Min (PK+) 158 ± 23 2,6
900 MPa, 60°, 120 Min (PK+) 155 ± 26 2,7
Sie errechnen also eine beträchtliche und mit der Druckeinwirkungszeit zunehmende Inaktivierung, obwohl die Zunahme der mittleren Inkubationszeiten gar nicht so beeindruckend aussieht. Gestützt auf nur eine in ihrem Sinne besonders günstige Quelle behaupten sie, intrazerebrale seien um den Faktor 1 Milliarde effektiver als orale Inokulationen und daher sei die mit Hochdruck erreichte Inaktivierung um gut 6 Größenordnungen ausreichend. Taylor et al. berechneten aufgrund von BSE-Übertragungsexperimenten mit RIII-Mäusen, dass die Infektiosität bei oraler Aufnahme bei Übertragungen von Rind zu Maus nur etwa um den Faktor 700 geringer als bei intrazerebraler Inokulation sei [ALMQ]. Ich kann daher diesen Optimismus nicht teilen, aber der Effekt ist immerhin besser als nichts, und effektivere Behandlungen sind ja bei Lebensmitteln nicht anwendbar.
Nur per Western blot erkundeten die Autoren den Effekt unterschiedlicher pH-Werte auf die Wirkung der Druckbehandlung von 800 MPa bei 60° über 120 Minuten. Zwischen pH 7,4 und pH 7,9 ist im Western blot kein Unterschied erkennbar, aber bei pH 5,6 blieb auch nach der Inkubation mit Proteinase K eine starke Bande erhalten. Dabei ist zu beachten, dass PBS kein druckstabiler Puffer ist. Während der Druckbehandlung sinkt der pH-Wert deutlich ab, aber das scheint dann im Gegensatz zum anfänglichen pH-Wert keinen wesentlichen Effekt mehr zu haben. Eine Erklärung für den pH-Wert-Effekt könnte sein, dass niedrige pH-Werte in PBS die ß-Faltblatt-Konformationen des Prionproteins fördern [AKRO].
Ebenfalls nur per Western blot untersuchten die Autoren den Effekt unterschiedlicher PBS-Konzentrationen auf die Wirkung der Druckbehandlung von 800 MPa bei 60° über 120 Minuten. Ebenso effektiv wie in Wasser war die Druckbehandlung nur bei einfacher PBS-Konzentration. In 0,1-0,5facher sowie bei 2facher PBS-Konzentration blieb nach der Inkubation mit Proteinase K eine schwache bis sehr schwache Bande erhalten. Bei 10facher PBS-Konzentration blieb die Inkubation mit Proteinase K trotz der Druckbehandlung fast wirkungslos.
Insgesamt stellt also die Abhängigkeit der Effektivität von pH-Werten und Salzkonzentrationen die Brauchbarkeit der Hochdruckbehandlung zur Prionen-Inaktivierung in Frage. Trotzdem scheint diese Methode momentan alternativlos zu sein, wo die effektiveren Inaktivierungsmethoden beispielsweise in Lebens- oder futtermitteln zu großen Schaden anrichten würden. Allerdings meinen die Autoren selber, für akzeptable Inaktivierungsergebnisse solle das zu inaktivierende Material zunächst homogenisiert und auf einen neutralen pH-Wert gebracht werden.
Genau wie beim Erhitzen erweist sich auch bei der Hochdruckbehandlung ein sehr kleiner aber nicht zu vernachlässigender Teil der TSE-Infektiosität als resistent. Während der größte Teil der Infektiosität zeitabhängig und durchaus effektiv inaktiviert wird, lässt sich der kleine resistente Rest auch durch sehr lange Behandlungen nicht weiter reduzieren. Es scheint so, als besäße nur dieser kleine Teil der Prionen einen noch unbekannten zusätzlichen Stabilisierungsfaktor.
MH Animals; Brain/metabolism; Buffers; Chemistry, Physical; Cricetinae; Endopeptidase K/*chemistry/metabolism; Hydrogen-Ion Concentration; *Hydrostatic Pressure; PrPsc Proteins/*chemistry/metabolism/pathogenicity; Research Support, Non-U.S. Gov't; Time Factors
AD Federal Research Center for Nutrition and Food, Institute of Chemistry and Biology, Karlsruhe, Germany. philipp.heindl@bfe.uni-karlsruhe.de
SP englisch
PO Brasilien