NR ASVV
AU Sarafoff,N.I.; Bieschke,J.G.; Giese,A.; Weber,P.; Bertsch,U.; Kretzschmar,H.A.
TI Automated PrPres amplification using indirect sonication
QU Journal of Biochemical and Biophysical Methods 2005 Jun 30; 63(3): 213-21
PT journal article
AB Prions, which mainly consist of the scrapie isoform of the prion protein (PrPsc), induce the misfolding of the physiological prion protein (PrPc). The Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), a process consisting of sonication and incubation, is one of the few methods thought to model autocatalytic prion replication and generation of proteinase K (PK)-resistant PrP (PrPres) in vitro. Here we show for the first time that the amplification may be achieved through direct as well as indirect sonication (water bath sonication using sealed sample containers), allowing the PMCA method to be automated. The automated method may serve as a valuable tool in high throughput screening for the diagnosis or compound identification for treatment of prion disease. The in vitro amplification process is weakly facilitated by divalent cations such as Mn, Zn and Ni, but not Cu, however, the presence of metal ions decreases the stability of PrPres against proteinase K digestion.
IN
Die "Protein Misfolding Cyclic Amplification" (PMCA) genannte Methode der Unterbrechung einer in vitro Konversion normalen Prionproteins PrPc durch das in einem Probenhomogenat enthaltene PrPsc durch eine die bereits gebildeten Aggregate zerkleinernde und damit die Zahl der katalytischen Kristallisationspunkte vermehrende Ultraschallbehandlung lässt sich automatisieren, indem man die Reaktionsansätze in Beutel einschweißt und viele Beutel in einem Heizwasserbad mit Ultraschall behandelt. So lässt sich ein empfindliches Nachweisverfahren auch auf große Probenzahlen anwenden.
Die in vitro durchgeführte Umwandlung normalen Prionproteins durch PrPsc lässt sich durch die divalenten Kationen Mangan, Zink und Nickel, jedoch nicht durh Kupfer beschleunigen. Gleichzeitig reduzieren diese Inonen aber auch die Resistenz des PrPsc gegenüber der Proteinase K.
MH Animals; Automation; Biophysics/*methods; Cations; Copper/chemistry; Edetic Acid/pharmacology; Endopeptidase K/chemistry; Hamsters; Ions; Magnesium/chemistry; Mesocricetus; Nickel/chemistry; Prions/*chemistry; Protein Folding; Research Support, Non-U.S. Gov't; Sonication; Temperature; Time Factors; Water/chemistry; Zinc/chemistry
AD Centre for Neuropathology, Prion Research Ludwig-Maxmilians-University Feodor-Lynen-Str. 23, 81377 Munich, Germany. n.sarafoff@gmx.net
SP englisch
PO Niederlande