NR AQSJ
AU Castilla,J.; Gutierrez-Adan,A.; Brun,A.; Doyle,D.; Pintado,B.; Ramirez,M.A.; Salguero,F.J.; Parra,B.; Diaz San Segundo,F.; Sanchez-Vizcaino,J.M.; Rogers,M.; Torres,J.M.
TI Subclinical bovine spongiform encephalopathy infection in transgenic mice expressing porcine prion protein
QU Journal of Neuroscience 2004 May 26; 24(21): 5063-9
PT journal article
AB The bovine-porcine species barrier to bovine spongiform encephalopathy (BSE) infection was explored by generating transgenic mouse lines expressing the porcine prion protein (PrP) gene. All of the porcine transgenic (poTg) mice showed clinical signs of BSE after intracerebral inoculation with a high-titer BSE inoculum. The protease-resistant PrP (PrPres) was detected in 14% (3 of 22) of the BSE-infected poTg mice by immunohistochemical or immunoblot analysis. Despite being able to infect 42% (5 of 12) of control mice, a low-dose BSE inoculum failed to penetrate the species barrier in our poTg mouse model. The findings of these infectivity studies suggest that there is a strong species barrier between cows and pigs. However, after second-passage infection of poTg mice using brain homogenates of BSE-inoculated mice scoring negative for the incoming prion protein as inoculum, it was possible to detect the presence of the infectious agent. Thus, porcine-adapted BSE inocula were efficient at infecting poTg mice, giving rise to an incubation period substantially reduced from 300 to 177 d after inoculation and to the presence of PrPres in 100% (21 of 21) of the mice. We were therefore able to conclude that initial exposure to the bovine prion may lead to subclinical infection such that brain homogenates from poTg mice classified as uninfected on the basis of the absence of PrPres are infectious when used to reinoculate poTg mice. Collectively, our findings suggest that these poTg mice could be used as a sensitive bioassay model for prion detection in pigs.
IN
Material und Methoden
Die Autoren erzeugten durch Gentechnik, Mikroinjektion der Genkonstrukte (kodierende Sequenz des Schweineprionproteins in einem Expressionsvektor unter der Kontrolle des Mausprionproteinpromotors) und anschließende Kreuzung transgene Mäuse, welche nur das Prionprotein von Schweinen, dieses aber unterschiedlich stark exprimieren. Die Mauslinie poTg001 exprimiert das Prionprotein des Schweins im Gehirn viermal, die Mauslinie poTg027 sechzehnmal so stark wie ein Schweinehirn. Im Verhalten der transgenen Mäuse entdeckten die Autoren keine Auffälligkeiten, aber teilweise hatten sie unabhängig vom Ausmaß der PrPc-Überexpression im Alter insbesondere in den Hinterbeinen Bewegungsstörungen. Außerdem fanden die Autoren auch bei alten lediglich mit PBS inokulierten Mäusen stellenweise Löcher im Gehirn. Dieser Effekt war aber abhängig vom Ausmaß der PrPc-Überexpression. Westaway et al. hatten dieses Phänomen auch schon beobachtet [AMKA].
Als Inokulum für die erste Passage wurden drei verschiedene Präparationen verwendet. BSE1 war ein Homogenat (10% in PBS) aus 49 BSE-infizierten Rinderhirnen von der Veterinary Laboratory Agency (VLA) im britischen New Haw, Addlestone. boTgBSE1 war ein Homogenat aus Gehirnen nur das Rinderprionpotein exprimierender transgener Mäuse (Linie 110 [ANPN]), die mit dem BSE1-Homogenat infiziert worden waren. BSE2 war ein Homogenat mit relativ hohem Titer von einem einzigen vom VLA gelieferten Hirnstamm eines BSE-infizierten Rindes. Mit Western blots zeigen die Autoren, dass das Inokulat BSE1 erheblich weniger konzentriert als die Inokulate BSE2 und boTgBSE1 war.
Die zweite Passage erfolgte mit Hirnhomogenaten von entweder PrPres-positiven (poTgBSE1 aus boTgBSE1 in Mauslinie 027) oder PrPres-negativen Mäusen (poTgBSE1-N1 und poTgBSE1-N2 aus BSE1 oder boTgBSE1 in Mauslinie 001) aus der ersten Passage.
Als Negativkontrolle wurden auch Mäuse nur mit PBS inokuliert.
Jeweils 5-15 erst 6-7 Wochen alte Mäuse wurden mit jeweils 20 µl Hirnhomogenat intrazerebral inokuliert. Die Tiere wurden getötet und histopathologisch, immunhistochemisch und per Western blot untersucht, wenn die ersten Sympome erkennbar wurden. Histopathologisch und immunhistochemisch wurden Medulla oblongata, Cerebellum, Diencephalon einschließlich Thalamus, Hippocampus und Großhirnrinde.
Ergebnisse
Zur Bestätigung der Infektiosität der in den eigentlich interessanten Experimenten verwendeten Inokula infizierten die Autoren auch normale nichttransgene sowie transgene Mäuse (boTg), die nur das Prionprotein des Rindes exprimieren. Das funktionierte bei den boTg110-Mäusen mit allen Inokula (BSE1, boTgBSE1, BSE2) gleich gut. Von den nicht transgenen Mäusen entwickelten durch das Inokulat BSE1 nur 5 von 12 Tieren nachweisbare Konzentrationen von PrPres, weil dessen niedriger Titer für die immunologisch nachweisbare Überwindung der Speziesbarriere nicht in jedem Fall ausreichte.
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Empfänglichkeit nur das Schweineprionprotein exprimierender transgener Mäuse für BSE- und PSE-Prionen
Rezipienten Inokulum Transgene Tod klinische PrPres
Expression a (Tage+/-SEM) TSE Nachweis
Symptome
erste Passage
Wildtyp BSE1 1x b 656+/-30 5/12 5/12
Mangelmutante BSE1 0x b 688+/-35 0/6 0/6
boTg110+/+ BSE1 8x 326+/-18 13/13 13/13
boTg110+/- BSE1 4x 359+/-15 11/11 11/11
poTg001+/+ BSE1 4x 587+/-17 6/6 0/6
poTg001+/- BSE1 2x 617+/-31 10/10 0/10
poTg027+/+ BSE1 16x 411+/-16 9/9 0/9
poTg027+/- BSE1 8x 572+/-23 14/14 0/14
boTg110+/+ BSE2 8x 308+/-5 5/5 5/5
poTg001+/+ BSE2 4x 488+/-4 6/6 1/6
poTg027+/+ BSE2 16x 294+/-14 5/5 1/5
boTg110+/+ boTgBSE1 8x 291+/-18 6/6 6/6
poTg001+/+ boTgBSE1 4x 528+/-17 6/6 0/6
poTg027+/+ boTgBSE1 16x 310+/-48 5/5 1/5
zweite Passage
Wildtyp poTgBSE1 1x >400 5 e 5 e
boTg110+/+ poTgBSE1 8x 367+/-17 5/5 5/5
poTg001+/+ poTgBSE1 4x 198+/-4 15/15 15/15
poTg027+/+ poTgBSE1 16x 177+/-9 6/6 6/6
Wildtyp poTgBSE1-N1* 1x >600 9 e 9 e
boTg110+/+ poTgBSE1-N1 8x >500 5 e 5 e
poTg001+/+ poTgBSE1-N1 4x 406+/-23 9/9 0/9
poTg001+/+ poTgBSE1-N2** 4x 269+/-23 6/6 2/6
boTg110+/+ PBS-inokuliert 8x 599+/-27 0/5 0/5
poTg001+/+ PBS-inokuliert 4x 585+/-18 9/9 0/9
poTg027+/+ PBS-inokuliert 16x 421+/-35 5/5 0/5
Wildtyp = normale nichttransgene Mäuse (B6 x CBA x 129Ola)
Mangelmutante = nichttransgene Mäuse ohne Prionproteinexpression
a = relativ zur PrP-Expression in Rind und Schwein
b = relativ zur PrP-Expression in Mäusen
e = noch lebend
+/+ bzw. +/- = homozygot bzw. heterozygot für das Prp-Genkonstrukt vor dem Hintergrund fehlender bzw. defekter eigener Mausprionproteingene
* Inokulum von BSE1-infizierten, aber klinisch und im Western blot negativen poTg-Mäusen
** Inokulum von boTgBSE1-infizierten, aber klinisch und im Western blot negativen poTg-Mäusen
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Mit dem BSE1-Homogenat inokulierte transgene Mäuse der Linien PoTg001 und poTg027 lebten offensichtlich aufgrund einer relativ niedrigen Erregerkonzentration ohne Anzeichen einer BSE-Infektion etwa ebenso lange wie lediglich mit PBS inokulierte Kontrolltiere. In ihren Gehirnen wurde per Western blot und Immunhistochemie kein PrPres gefunden und auch histopathologisch unterschieden sie sich nicht von den nur mit PBS inokulierten Negativkontrollen, die im Alter von 520-730 Tagen getötet wurden.
Im Gegensatz dazu erkrankten alle transgenen Mäuse der Linien PoTg001 und poTg027, wenn sie mit den Homogenaten boTgBSE1 oder BSE2 mit ihren höheren Titern inokuliert wurden. Immunhistochemisch wurde in ihnen das PrPsc granulär innerhalb und außerhalb des neuronalen Zytoplasmas sowie punktuell im Neuropil markiert. Histopathologisch wurde schwere Vakuolisierung stets zusammen mit einer Astrogliose gesehen, wobei die Fortsätze der Astrozyten in die Vakuolen hinein wuchsen. Gelegentlich waren die Zytoplasmen der Astrozyten auch vergrößert. Verglichen mit den lediglich mit PBS inokulierten Negativkontrollmäusen nahm die Überlebenszeit bei beiden Mauslinien PoTg001 und poTg027 um 100 Tage ab, wenn sie mit dem hohen Titer des Homogenates BSE2 inokuliert wurden. Bei 1 von 5 poTg027-Mäusen und 1 von 6 poTg001-Mäusen lag auch die PrPres-Konzentration im Gehirn über der Nachweisgrenze von Western blot und Immunhistochemie. Ebenso groß war die Reduktion der Überlebenszeit bei der Mauslinie poTg027, wenn sie mit dem Homogenat boTgBSE1 aus den Gehirnen BSE-infizierter Mäuse inokuliert wurden, die selber nur das Rinderprionprotein exprimierten. In diesem Experiment konnte PrPres bei einer von fünf Mäusen per Western blot nachgewiesen werden. Bei Mäusen der Linie poTg001 reduzierte eine Inokulation mit dem Homogenat boTgBSE1 die Lebensdauer nur um rund 60 Tage und die Autoren konnten in keiner der 6 infizierten Mäuse das PrPres nachweisen.
Hirnhomogenate mit immunologisch nachweisbaren PrPres-Konzentrationen von BSE-infizierten poTg027-Mäusen wurden für eine zweite Passage in poTg001-, poTg027- und boTg110-Mäusen verwendet. Im Western blot erwies sich das aus BSE-infizierten, das Schweine-Prionprotein exprimierenden transgenen Mäusen gewonnene Inokulat poTgBSE1 als ähnlich konzentriert wie die Inokulate boTgBSE1 und BSE2. Auch immunhistochemisch sahen mit dem poTgBSE1-Homogenat inokulierten Mäuse mit Schweineprionprotein ähnlich aus wie mit dem BSE1-Homogenat inokulierten Mäuse mit dem Rinderprionprotein. In beiden Fällen fand man histopathologisch eine Vakuolisierung des Neuropils und eine Astrozytenreaktion, welche genau wie das immunhistochemisch gefundene Muster dem ähnelten, was man bei BSE [AMJI] und bei mit BSE infizierten Schweinen [AKGY] sah. Alle mit dem Homogenat poTgBSE1 inokulierten poTg-Mäuse erkrankten nach verglichen mit der ersten Passage deutlich reduzierter Überlebenszeit und in allen Gehirnen ließ sich per Western blot das PrPres nachweisen. Demnach wurde die Speziesbarriere während der ersten Passage überwunden. Vor der ersten Passage lieferten alle 3 Inokula im Western blot identische Muster, aber nach der ersten Passage in poTg-Mäusen war das Muster anders und blieb so auch nach den folgenden Passagen.
Auch alle boTg110-Mäuse wurden mit dem poTgBSE1-Inokulum erfolgreich infiziert und entwickelten in ihren Gehirnen per Western blot nachweisbare Konzentrationen von PrPres. Dies spricht dafür, dass die Speziesbarriere vom Schwein zum Rind geringe als in der umgekehrten Richtung ist.
Histopathologisch und immunhistochemisch waren die Ergebnisse dieser zweiten Passage ähnlich wie in der ersten Passage nach Inokulationen mit dem konzentrierteren Inokulat BSE2.
Schließlich kam den Autoren die Idee, die nach Inokulation mit BSE-Infektiosität in der ersten Passage nicht erkrankten Mäuse könnten trotz negativer Western blots subklinisch infiziert gewesen sein. Deshalb homogenisierten sie die Hirne zweier poTg001-Mäuse (poTgBSE1-N1, poTgBSE1-N2), die scheinbar erfolglos mit den Homogenaten BSE1 (poTgBSE1-N1) bzw. boTgBSE1 (poTgBSE1-N2) inokuliert worden waren. Diese beiden neuen Inokula wurden nun für eine zweite Passage in poTg001-Mäusen eingesetzt. Statt 587+/-17 Tage überlebten die mit dem Homogenat poTgBSE1-N1 inokulierten 9 Mäuse nur 406+/-23 Tage, obwohl in keiner von ihnen per Western blot PrPres nachgewiesen werden konnte. Noch deutlicher reduzierte das Inokulum poTgBSE1-N2 die Überlebensdauer von 6 poTg001-Mäusen auf nur noch 269+/-23 Tage und die Tiere zeigten Symptome. Bei 2 von 6 Mäusen konnte außerdem PrPres per Western blot nachgewiesen werden.
MH Amino Acid Sequence; Animals; Brain/metabolism/pathology; Brain Chemistry; Carrier State; Cattle; Disease Susceptibility; Encephalopathy, Bovine Spongiform/*genetics/pathology/*transmission; Immunohistochemistry; Mice; Mice, Transgenic; Molecular Sequence Data; Prions/genetics/isolation & purification/*metabolism/*pathogenicity; Research Support, Non-U.S. Gov't; Sequence Alignment; Species Specificity; Swine; Transgenes
AD Centro de Investigacion en Sanidad Animal, Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria, Valdeolmos, 28130 Madrid, Spain.
SP englisch
PO USA
ZF kritische Zusammenfassung von Roland Heynkes