NR AJSY
AU Prusiner,S.B.; Groth,D.F.; Cochran,S.P.; Masiarz,F.R.; McKinley,M.P.; Martinez,H.M.
TI Molecular properties, partial purification, and assay by incubation period measurements of the hamster scrapie agent
QU Biochemistry 1980 Oct 14; 19(21): 4883-91
PT journal article
AB The scrapie agent causes a progressive degeneration of the central nervous system of animals after a prolonged incubation period. Measurements of incubation period length, defined as the time from inoculation to the onset of clinical signs of neurological dysfunction, were related to the titer of the agent and the dilution of the inoculated sample. Equations defining the relationship provide a new assay for the agent requiring fewer animals than end point titrations. By use of this incubation period assay, the scrapie agent from hamster brain was found to have an s20,w of < 300 S but > 30 S assuming rho p = 1.2 g/cm3. A partially purified fraction P3 was obtained by differential centrifugation and sodium deoxycholate extraction. When P3 was extracted with phenol, virtually no infectivity was found in the aqueous phase even after examining such variables as pH, salt concentration, and predigestion of samples with proteinase K. Nonionic and nondenaturing, anionic detergents did not inactivate the scrapie agent; in contrast, denaturing detergents inactivated the agent. Sodium dodecyl sulfate (NaDodSO4) inactivated greater than 90% of the agent at a NaDodSO4 to protein ratio of 1.8 g/g. Inactivation by NaDodSO4 appears to be a cooperative process. Addition of a nonionic detergent to form mixed micelles with NaDodSO4 prevented inactivation of the agent by NaDodSO4. Weak chaotropic ions do not inactivate the scrapie agent while strong chaotropic ions like SCN- and Cl3CCOO- destroy infectivity at concentrations of 0.2 M. These data provide evidence in support of a protein component within the scrapie agent which is essential for maintenance of infectivity. Thus, it is unlikely that the scrapie agent is composed only of a "naked" nucleic acid as is the case for the plant viroids.
IN Die Autoren entwickelten einen weit weniger aufwendigen Test zur Quantifizierung der Scrapie-Infektivität, in dem sie diese ins Verhältnis zur Inkubationszeit setzten. Wird das infektiöse Agens in bis zu 7 Schritten jeweils 1:10, also logarithmisch verdünnt, dann nimmt die Inkubationszeit linear zu. Trotz einer relativ großen Streuung der Meßpunkte meinen die Autoren, dass die Linearität der Inkubationszeitzunahme bei sehr geringen Konzentrationen des Erregers nicht mehr linear sei und glauben deshalb mehr als einen exponentiellen Faktor zu erkennen. Mit Hilfe dieses biologischen Tests waren sie in der Lage, eine Prozedur zur Anreicherung des Erregers zu entwickeln und dessen Eigenschaften zu studieren. Die Autoren bemerken, dass er sich wie ein Membranprotein verhält, jedoch in mancher Hinsicht extrem variabel ist. Der Scrapie-Überträger ist sehr hydrophob. Nach Phenol-Extraktionen enthält die wäßrige Phase keinerlei Infektiosität und der Erreger scheint inaktiviert zu sein. Durch Ethanol wird er gefällt aber nicht inaktiviert. Nicht ionische und nicht denaturierende anionische Detergentien können das Scrapie-Agens nicht inaktivieren. Dagegen inaktiviert das denaturierende Detergens SDS bei einem Verhältnis SDS : Protein von 1,8 : 1 g in einem anscheinend kooperativen Prozeß mehr als 90% der Infektiosität. Bis zu einer Konzentration von 0,5 % zeigte das SDS keine Wirkung. Nach 3 Stunden bei 25° in 1% SDS waren nur noch 10% der Infektivität übrig. In 3% SDS war die Inaktivierung unter gleichen Bedingugnen praktisch vollständig. SDS wird unwirksam, wenn zuvor ein nicht ionisches Detergens zugegeben wurde. Sarkosyl, welches sich von SDS nur durch den Austausch der Sulphatgruppe unterscheidet, ist unwirksam. Stark chaotrophe Ionen wie Thiocyanat (SCN-) oder Trichloressigsäure (Cl3CCOO-) zerstören bei einer Konzentration von 0,2 M die Infektiosität, während schwache Chaotrophe nicht ausreichen. Die Inaktivierung durch Thiocyanat scheint aber reversibel zu sein, wenn nicht chaotrophe Salze zugegeben oder die Thiocyanat-Ionen durch Dialyse entfernt werden. Das infektiöse Scrapie-Agens wird also durch denaturierende Detergentien, stark chaotrophe Ionen sowie aggressive organische Lösungsmittel inaktiviert. Weil Nukleinsäuren durch chaotrophe Ionen nicht angriffen werden, muß ein Protein für die Infektiosität zumindest mitverantwortlich sein. Nach der 8. Hamster-Passage eines Scrapie-Erregers enthielt ein Hamstergehirn 10 Milliarden LD50-Einheiten pro Gramm.
MH Animal; Brain/microbiology; Centrifugation; Detergents/pharmacology; Female; Hamsters; Mesocricetus; Methods; Prions/drug effects/*isolation & purification; Scrapie/*microbiology; Sheep; Support, U.S. Gov't, Non-P.H.S.; Support, U.S. Gov't, P.H.S.
AD Stanley B. Prusiner, Department of Neurology and Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco 94143, California
SP englisch
PO USA
OR Prion-Krankheiten 6
ZF kritische Zusammenfassung von Roland Heynkes