NR ADKU

AU Diringer,H.; Roehmel,J.; Beekes,M.

TI Effect of repeated oral infection of hamsters with scrapie

QU Journal of General Virology 1998 Mar; 79(3): 609-12

PT journal article

AB The development of a transmissible spongiform encephalopathy upon uptake of the infectious agent in feed was studied in the model system scrapie in hamsters. Compared to single dosing, repeated dosing caused disease at a considerable higher incidence. The risk of infection was higher when the time interval between repetitive dosing was short. There was a statistically significant trend of clearance of infectivity with time.

ZR 12 Zitate

VT Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), of which scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are the most important, all are fatal degenerative diseases of the central nervous system. The agents causing these diseases are still undefined. Upon infection TSEs exhibit a very extended incubation period lasting years or even decades during which infected individuals cannot be identified (for review see Gajdusek, 1996). This is an uncomfortable, serious situation because infection by oral uptake of agent, as first suggested by Pattison & Millson (1961), could play a very important role in transmission of TSEs within an animal species or between species (for review see Diringer et al., 1994).
More recently, theoretical considerations (Diringer, 1995) as well as the appearance of a new variant of CJD in young patients in the United Kingdom have increased the likelihood that CJD in humans may also be attributable to this form of transmission (Will et al., 1996). Thus, recently we have begun to address more intensively the pathogenesis of TSEs after oral infection using the model system scrapie in hamster (Beekes et al., 1996; Baldauf et al., 1997).
Oral or intragastric infection was found to be about 50000-100000-fold less effective in mice (Kimberlin & Walker, 1989; Diringer et al., 1994) and in hamsters (Diringer et al., 1994), as compared to an intracerebral (i.c.) route, although a difference of 10^9 has also been reported for the hamster model (Prusiner et al., 1985).
In an initial study on the development of disease after uptake of limited amounts of scrapie agent it was shown that doses of infectivity which did not result in disease when given once resulted in a low incidence of scrapie cases in hamsters when given repeatedly (Diringer et al., 1994). Here this observation is studied in more detail.
The experimental design was as follows: outbred Syrian hamsters and the scrapie strain 263K (Kimberlin & Walker, 1977) were used. Two pools for infection were prepared as 1:10 homogenates in PBS from scrapied hamsters at the terminal stage of disease. Such brains contain 1-3 x 10^9 LD50 i.c./g (unpublished results of more than 20 end-point titrations). After centrifugation for 5 min at 500 g the pellet and lower third of the supernatant were discarded and the upper two-thirds of the supernatant was used as a pool for infection.
Throughout the experiment the animals were kept singularly in their cages. They were infected intracerebrally with 50 µl of tenfold dilutions of the pool materials to determine the LD50 i.c. dose.
For oral infection the animals were starved for 1 day. The next day they received a single pellet of feed soaked with 100 µl of tenfold dilutions of the pools (schedule 1). Hamsters exposed several times were given the infectious pellets 10 times at intervals of 1 (schedule 2) and 4 days (schedule 3). Subsequently pelleted feed and water were given ad libitum. The animals were scored twice weekly for clinical symptoms. LD50 were determined by the method of Spearman-Kärber as described by Bonin (1973).
Table 1 presents the results of two end-point titrations performed with each of the two pools by an i.c. inoculation. As compared to an LD50 of 3x10^9 in total homogenates of scrapie hamster brains (see earlier) titres of 1-3x10^8 LD50 i.c./g of brain tissue in the pools demonstrate that the procedure to prepare this material by centrifugation resulted in a loss of 90% of the infectivity into the pellet and the lower third of the supernatant.
End-point titrations with each of these pools by oral infection revealed infectivity titres of 2-3x10^8 LD50. Thus, these data confirm the earlier observations (Kimberlin & Walker, 1989; Diringer et al., 1994) that oral infection is 50000-100000-fold less effective than i.c. infection. They do not support the finding of a difference in eficiency of 10^9 between these two routes (Prusiner et al., 1985).
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Table 1. Determination of LD50 in two scrapie pools from hamster brain after intracerebral (i.C.) and oral infection
Log Incidence of scrapie cases per infected Cumulation
dilution animals and incubation periods (days pi. +/- SE) death
Intracerebral infection Oral infection rate and
Pool 1 Pool 2 Pool 1 Pool 2 incidence
a b a b
-1 10/10 9/10 10/10 29/30
153+/-3 146+/-6 148+/-2 0.97
-2 14/20 13/20 16/20 15/20 58/80
167+/-4 176+/-5 157+/-6 186+/-8 0.73
-3 2/20 2/20 4/20 1/20 9/80
188,231 137,175 187+/-4 202 0.11
-4 0/20 0/20 0/20 1/20 1/80
202 0.01
-5 5/5 5/5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/40
112+/-3 106+/-3 0.00
-6 5/5 5/5
113+/-3 119+/-2
-7 1/6 3/5
156 126,200,207
-8 0/7 1/5
115
-9 0/5 0/5
LD50* 1x10^8 3x10^8 2x10^3 2x10^3 3x10^3 2x10^3
* per gram of processed brain
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Table 2. Effect of repeated feeding of scrapie agent to hamsters
Log Single doses Incidence of scrapie cases per Cumulative
dilu- infected animals and incubation death rate
tion periods (days pi. +/- SE) and incidence
Feeding schedule
Tissue LD50 LD50 Daily Every fourth day Daily Every
(mg)* i.c. orally Pool 1 Pool 2 Pool 1 Pool 2 fourth
day
-2 1 2x10^5 2 20/20 19/19 20/20 18/18 20/20 20/20 59/59 58/58
159 157 155 181 165 170 1 1
+/-2 +/-2 +/-4 +/-8 +/-3 +/-3
-3 0,1 2x10^4 0,2 8/19 17/20 8/20 2/18 14/20 10/20 33/59 26/58
178 177 234 198, 197 195 0,56 0,45
+/-7 +/-7 +/-23 206 +/-6 +/-15
-4 0,01 2x10^3 0,02 0/20 1/20 2/20 0/17 1/20 1/20 5/60 2/57
181,188 192 160,174 206 234 0,08 0,04
-5 0,001 2x10^2 0,002 0/20 0/20
Termination of
experiments 262 300 440 262 330 440
(days post first
infection)
* Amount of brain from which a single dose of extract was prepared.
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Table 2 shows the results of experiments in which animals received multiple oral doses of scrapie agent at intervals of 1 and 4 days. Doses relating to 2x10^5, 2x10^4, 2x10^3 and, in one case, 2x10^2 LD50 i.c. were fed, representing 100 µl of 10^-2, 10^-3, 10^-4 and 10^-5 dilutions, respectively (see Table 1).
Comparing the results of a single oral infection in Table 1 with multiple infections in Table 2 it is obvious that, independent of the feeding schedule, hamsters receiving the same infectious dose several times bear a higher risk of developing scrapie. For example, of hamsters receiving 100 µl of 10^-2, 10^-3 and 10^-4 once (Table 1, cumulative death rate), 58/80, 9/80 and 1/80 animals developed scrapie, respectively. When the same dilutions were given 10 times at 1 or 4 day intervals (Table 2, cumulative death rates) 59/59, 33/59 and 5/60, or 58/58, 26/58 and 2/57 animals died of scrapie.
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Table 3. Statistical evaluation of the experimental data given in Tables 1 and 2
(a)*
Log Schedule 1 Schedule 2 Schedule 3
dilu- No. No. not No. No. not No. No. not
tion infected infected infected infected infected infected
-2 29 (97%) 1 59 (100%) 0 58 (100%) 0
-3 58 (73%) 22 33 ( 56%) 26 26 ( 45%) 32
-4 9 (11%) 71 5 ( 8%) 55 2 ( 4%) 55
-5 1 ( 1%) 79 0 ( 0%) 20
-6 0 ( 0%) 40
(b)+
Log Schedule 1 Schedule 2 Schedule 3
dilution
-2 100% 100% 100%
-3 65% 56% 44%
-4 10% 8% 6%
-5 1% 0%
-6 0%
(c)#
Comparison Difference 95% Cl P value (1-sided)
Schedule 1 vs 2 9% (-4%, 28%) 0,119
Schedule 1 vs 3 21% ( 7%, 35%) 0,002
Schedule 2 vs 3 12% (-6%, 24%) 0,073
* Cumulative death rates for the various feeding schedules. Note that in Table 1 the data for schedule 1 are presented in log dilution -1 to -5 instead of -2 to -6, but because schedule 1 always means tenfold doses, the two presentations are equivalent.
+ Estimated probabilities from the maximum likelihood method.
# Estimated differences with 95% confidence intervals between feeding schedules and corresponding P values.
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IN Für das Experiment wurden syrische Hamster (Goldhamster) aus einer Nicht-Inzucht und der Hamster-Scrapiestamm 263K verwendet. Obwohl es sich nicht um eine reine Inzuchtlinie handelte, waren die Hamster nach der Erinnerung von Prof. Diringer hinsichtlich des Prionproteins alle identisch. Hinsichtlich anderer Gene mit Einfluß auf die Inkubationszeit könnte es allerdings Unterschiede gegeben haben. Während des Experimentes wurden die Tiere einzeln gehalten und vor jeder oralen Inokulation mussten sie einen Tag hungern. Dann erhielten die Hamster ein mit 100 µl Hirnhomogenat getränktes Futterpellet und anschließend soviel Futter und Wasser, wie sie wollten. Die Autoren beschreiben allerdings nicht, wie dies bei wiederholter Inokulation mit Abständen von nur 1 Tag funktionieren soll. Telephonisch erklärte mir Prof. Diringer, man habe tatsächlich die Hamster nur vor einmaligen und vor jeder der im Abstand von jeweils 4 Tagen durchgeführten Inokulation einen Tag hungern lassen. Ich frage mich auch, wie sich wohl wiederholtes Hungern auf die Aufnahme der Infektiosität ausirkt. Prof. Diringer sah darin im persönlichen Gespräch kein Problem, konnte eine Auswirkung auf die Empfänglichkeit gegenüber oralen Infektionen aber auch nicht ausschließen.
Leider erwähnten die Autoren in dem Artikel auch nicht das Alter der Hamster zu den Zeitpunkten der Inokulation. Aber telephonisch teilte mir Prof. Diringer mit, nach seiner Erinnerung seien die Hamster zu Beginn der Übertragungsexperimente normalerweise 10-15 Wochen alt gewesen. Das einige Wochen mehr oder weniger in diesem Alter unterschiedliche Empfänglichkeiten gegenüber Infektionen bewirken könnten, glaubte er nicht. Auch bei deutlich älteren Hamstern habe er nie eine veränderte Empfänglichkeit wahrgenommen, gezielt untersucht habe man das aber auch nicht. Es könnte also durchaus sein, dass während des fast 7-wöchigen Zeitraums der wiederholten Inokulation die Empfänglichkeit gegenüber Infektionen bei den anfangs erst 10-15 Wochen alten Hamstern abnahm und die Ergebnisse beeinflussten. Bei BSE und besonders bei der nvCJK scheinen ja sehr junge Rinder bzw. Menschen eine stark erhöhte Empfänglichkeit zu haben, obwohl eine erhöhte Belastung mit infektiöser Nahrung nicht völlig auszuschließen ist.
Die Autoren produzierten aus den in der zehnfachen Menge PBS homogenisierten (1:10 verdünnten) Hirnen Scrapie-infizierter Hamster im Endstadium zwei pools, die sie 5 Minuten bei 500 g zentrifugierten, um nur die oberen 2/3 des Überstandes für die Übertragungsexperimente zu verwenden. Von jedem pool wurden 8 Verdünnungen in Schritten von jeweils 1:10 hergestellt. Aus mehr als 20 unveöffentlichten Endpunkttitrationsexperimenten wussten die Autoren, dass die Gehirne ihrer mit 263K Scrapie-infizierten Hamster im Endstadium 1-3 x 10^9 LD50 i.c./g enthalten. Sie ermittelten aber auch für diese beiden pools die LD50 i.c./g, indem sie Hamster mit je 50 µl verschiedener 1:10-Verdünnungsstufen intrazerebral inokulierten. Dabei stellte sich heraus, dass man mit dem pellet und dem unteren Drittel des Überstandes rund 90% der Infektiosität verloren und für das Experiment in den beiden pools nur noch 1 bzw. 3x10^8 LD50 i.c./g übrig behalten hatte. Die Endpunkttitrationsexperimente mit oraler Inokulation ergaben 2-3x10^3 LD50/g. Die orale Inokulation erwies sich also als 50.000-100.000-fach weniger effektiv als die intrazerebrale.
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Tabelle 1. LD50-Bestimmung für die beiden pools von Scrapie-Hamsterhirnhomogenaten bei intrazerebraler (i.C.) bzw. oraler Inokulation
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Logarith- Scrapie-Fälle pro inokulierte Hamster und durch- Summen der
mus der schnittl. Inkubationszeiten +/- Standardabweichung Todesraten
Verdün- Intracerebral infection Oral infection und der
nung Pool 1 Pool 2 Pool 1 Pool 2 Inzidenz
a b a b
-1 10/10 9/10 10/10 29/30
153+/-3 146+/-6 148+/-2 0,97
-2 14/20 13/20 16/20 15/20 58/80
167+/-4 176+/-5 157+/-6 186+/-8 0,73
-3 2/20 2/20 4/20 1/20 9/80
188,231 137,175 187+/-4 202 0,11
-4 0/20 0/20 0/20 1/20 1/80
202 0,01
-5 5/5 5/5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/40
112+/-3 106+/-3 0,00
-6 5/5 5/5
113+/-3 119+/-2
-7 1/6 3/5
156 126,200,207
-8 0/7 1/5
115
-9 0/5 0/5
LD50/g 1x10^8 3x10^8 2x10^3 2x10^3 3x10^3 2x10^3
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Tabelle 2. Effekt wiederholter Fütterung von Hamstern mit Scrapie-Infektiosität
Logarith- Einzeldosen Inzidenz der Scrapie-Fälle pro Kumulative
mus der inokulierte Tiere und Inkubations- Todesraten
Verdün- perioden (Tage +/- Standardabweichung) und Inzidenz
nung Fütterungsplan
Gewebe LD50 LD50 tägliche Fütterung jeden 4. Tag täg- jeden
(mg)* i.c. oral Pool 1 Pool 2 Pool 1 Pool 2 lich 4. Tag
-2 1 2x10^5 2 20/20 19/19 20/20 18/18 20/20 20/20 59/59 58/58
159 157 155 181 165 170 1 1
+/-2 +/-2 +/-4 +/-8 +/-3 +/-3
-3 0,1 2x10^4 0,2 8/19 17/20 8/20 2/18 14/20 10/20 33/59 26/58
178 177 234 198, 197 195 0,56 0,45
+/-7 +/-7 +/-23 206 +/-6 +/-15
-4 0,01 2x10^3 0,02 0/20 1/20 2/20 0/17 1/20 1/20 5/60 2/57
181,188 192 160,174 206 234 0,08 0,04
-5 0,001 2x10^2 0,002 0/20 0/20
Beendingung der
Experimente (Tage 262 300 440 262 330 440
nach der ersten
Inokulation)
* Hirnmenge, aus der eine einzelne Dosis hergestellt wurde
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Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Experimente, in denen die Hamster in Abständen von einem bzw. vier Tagen zehnmal mit je 100 µl der jeweiligen Verdünnung gefüttert wurden. Die Angaben können allerdings meines Erachtens nicht ganz richtig sein, denn die Tabelle 1 weist für pool 1 nur ein Drittel der Infektiosität von pool 2 aus, während die Infektiosität beider pools laut Tabelle 2 gleich konzentriert gewesen sein soll. Wichtig ist auch, dass es hier um relativ kleine Zahlen mit erheblichen Schwankungen geht.
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Tabelle 3. Statistische Auswertung der experimentellen Daten aus den Tabellen 1 und 2
(a)*
Logarith- Zeitplan 1 Zeitplan 2 Zeitplan 3
mus der inoku- nicht
Verdün- lierte inokulierte
nung Hamster Hamster
a b a b
Log
dilu- No. No. not No. No. not No. No. not
tion infected infected infected infected infected infected
-2 29 (97%) 1 59 (100%) 0 58 (100%) 0
-3 58 (73%) 22 33 ( 56%) 26 26 ( 45%) 32
-4 9 (11%) 71 5 ( 8%) 55 2 ( 4%) 55
-5 1 ( 1%) 79 0 ( 0%) 20
-6 0 ( 0%) 40
(b)+
Log Schedule 1 Schedule 2 Schedule 3
dilution
-2 100% 100% 100%
-3 65% 56% 44%
-4 10% 8% 6%
-5 1% 0%
-6 0%
(c)#
Comparison Difference 95% Cl P value (1-sided)
Schedule 1 vs 2 9% (-4%, 28%) 0,119
Schedule 1 vs 3 21% ( 7%, 35%) 0,002
Schedule 2 vs 3 12% (-6%, 24%) 0,073
* Cumulative death rates for the various feeding schedules. Note that in Table 1 the data for schedule 1 are presented in log dilution -1 to -5 instead of -2 to -6, but because schedule 1 always means tenfold doses, the two presentations are equivalent.
+ Estimated probabilities from the maximum likelihood method.
# Estimated differences with 95% confidence intervals between feeding schedules and corresponding P values.
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Die oralen Inokulationen erfolgten bei jedem pool in 3 Gruppen. Eine Gruppe erhielt die Gesamtdosis bei einer Fütterung, während die beiden anderen Gruppen die Gesamtdosis aufgeteilt in 10 identische Einzeldosen in Abständen von jeweils 1 oder 4 Tagen erhielten. So erstreckte sich die Aufnahme der Infektiosität bei den drei Gruppen über 1, 10, oder 40 Tage.
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Ergebnisse und Diskussion
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Verdün- Pool 1 Pool 2
nungs- einmalig täglich alle 4 Tage einmalig täglich alle 4 Tage über über über über
stufe 10 Tage 40 Tage 10 Tage 40 Tage
- 1 10/10 ND ND 19/20 ND ND
- 2 27/40 20/20 18/18 31/40 39/40 40/40
- 3 4/40 8/19 2/18 5/40 25/40 24/40
- 4 0/40 2/20 0/17 1/40 3/40 2/40
- 5 0/20 0/20 ND 0/40 ND ND
Angaben: erkrankte Tiere/eingesetzte Tiere. ND = nicht durchgeführt.
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Das nur zehnfach verdünnte Gehirnmaterial führte bereits bei einmaliger Gabe bei nahezu 100% der Tiere zum Ausbruch der Erkrankung. Eine einmalige Gabe des hundertfach verdünnten Gehirnmaterials ließ die Erkrankung hingegen nur bei 2/3 bis 3/4 der infizierten Hamster zum Ausbruch kommen. Wurde diese Dosis jedoch zehnmal nacheinander verfüttert und damit von den Tieren insgesamt die gleiche Erregermenge aufgenommen wie bei der hundertprozent tödlichen Verdünnungsstufe, betrug auch hier die Erkrankungsrate 100%. Innerhalb derselben Verdünnungsstufe war die Erkrankungsrate bei mehrfacher Gabe deutlich höher als bei nur einmaliger. Die statistische Auswertung der kumulativen Todesraten ließ darüber hinaus mit zunehmender Verdünnung und größeren Abständen zwischen den einzelnen Dosen ein abnehmendes Risiko für die Hamster erkennen, innerhalb des Beobachtungszeitraums von 262 Tagen (Pool 1) bzw. 300 - 440 Tagen (Pool 2) an Scrapie zu erkranken.
http://www.pnas.org/cgi/reprint/1833677100v1.pdf

MH Administration, Oral; Animal; Drug Administration Schedule; Hamsters; Injections; Scrapie/*etiology/mortality; Support, Non-U.S. Gov't

AD Heino Diringer und Michael Beekes - Robert Koch-Institut, Bundesinstitut für Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten, Fachgebiet 123, Nordufer 20, 13353 Berlin, Germany;
Joachim Roehmel - Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, Seestr. 10, 13347 Berlin, Germany

SP englisch

PO England

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OR Prion-Krankheiten D

ZF kritische Zusammenfassung von Dr. Ingrid Schütt-Abraham

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