Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2005 Jul; 12(7): 814-20

Roland Heynkes, 28.7.2005

Gliederung

	bibliographische Angaben
	meine kritische Zusammenfassung des Artikels

Schütz,E.; Urnovitz,H.B.; Iakoubov,L.; Schulz-Schaeffer,W.; Wemheuer,W.; Brenig,B. - Bov-tA Short Interspersed Nucleotide Element Sequences in Circulating Nucleic Acids from Sera of Cattle with Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) and Sera of Cattle Exposed to BSE - Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2005 Jul; 12(7): 814-20

Die Autoren sammelten Blutserum noch lebender Rinder, die dem tierärztlichen Institut der Universität Göttingen als BSE-verdächtig gemeldet wurden. Außerdem sammelten sie das Serum von Kohortentieren, wenn die Kohorte mindestens 8 Tiere umfasste und die Autoren noch vor der Tötung Zugang dazu erhielten. Als Negativkontrollen wählten sie Rinder von Höfen, auf denen es bisher nie BSE-Fälle gab. Meistens wurde deren Blut erst kurz vor der Schlachtung gewonnen. Bei allen Negativkontrollen und Kohortentieren dieser Studie waren die Ergebnisse der BSE-Schnelltests negativ. Alle stammten von norddeutschen Höfen und beide Gruppen unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich ihrer Altersverteilung und Haltungsform. Insgesamt testeten die Autoren die Seren von 4 bestätigten BSE-Fällen, 137 Kohortentieren von 8 bestätigten BSE-Fällen sowie 845 gesunden Rindern, deren BSE-Tests keinen Verdacht aufkommen ließen.

Das Blut wurde einer Arterie oder Vene am Schwanz entnommen und jeweils in eine 18-ml-Spritze mit Gerinnungsbeschleuniger gezogen, in der es eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gerinnen konnte. Danach wurde es bei 2-8°C nicht länger als 24 Stunden gelagert und im selben Temperaturbereich mit 1000-facher Erdbeschleunigung 15 Minuten zentrifugiert. Die weitgehend zellfreien Überstände (Serum) wurden in 1,5 ml Mikrozentifugengefäßen bei -20 oder -80°C eingefroren. Später wurden diese Überstände bei 4°C aufgetaut und zur Entfernung größerer Zelltrümmer noch einmal 25 Minuten bei 4.000 g sowie 35 Minuten bei 20.000 g zentrifugiert. Die darin enthaltenen Nukleinsäuren wurden an speziell aktivierte Silikatmembranen in Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen von Macherey-Nagel gebunden, gereinigt und eluiert (durch Waschen mit geeigneter Salzkonzentration vom Träger gelöst). Die fertigen Nukleinsäure-Lösungen wurden bei -80°C gelagert. Da diese Nukleinsäuren aus zellfreiem Blutserum gewonnen werden, nennt man sie CNA. Laut Zusammenfassung der Autoren sollen sie aus der Vesikelfraktion des Serums stammen. Solche auch Exosomen genannte Mikrovesikel werden möglicherweise als Reaktion auf Zellstreß oder generell zur interzellulären Kommunikation ausgeschieden.

Von den CNA nimmt der Erstautor an (persönliche Kommunikation), daß sie bevorzugt aus den nicht kodierenden Regionen primärer RNA-Transkript entstehen. Deshalb scheinen das Gemisch der CNA sowie die Sequenzen der einzelnen CNA die Expressionsmuster der Zellen widerzuspiegeln, aus denen sie stammen. Wenn Krankheiten in bestimmten Zelltypen spezifische Expressionsmuster erzeugen, dann könnten sich demnach verschiedene Krankheiten auch durch die Zusammensetzung der CNA im Blutserum unterscheiden. Die Autoren wollten genau solche Unterschiede zwischen BSE-infizierten und nicht infizierten Rindern hinsichtlich der Zusammensetzung und/oder Sequenzen der CNA finden.

In ihrer Zusammenfassung schreiben die Autoren, in den zirkulierenden Nukleinsäuren (CNA) seien repetitive Sequenzen überrepräsentiert. Deshalb konzentrierten sie sich in ihrer Untersuchung der CNA auf eine Untergruppe der repetitiven Sequenzen, nämlich auf die SINE. Dazu setzten sie zunächst verschiedene Gemische von Primern ein und amplifizierten einfach per PCR alle CNA-Sequenzen, die zufällig zwischen zwei nicht zu weit von einander entfernten SINE-Erkennungssequenzen lagen, an denen auf der einen Seite der Strang und auf der anderen Seite dessen Gegenstrang mit jeweils einem PCR-Primer hybridisierte. So erhielten sie mit jedem Primer-Gemisch aus jeder CNA-Probe ein spezifisches Gemisch unterschiedlich langer DNA-Fragmente, deren gelelektrophoretische Auftrennung zu einem relativ leicht vergleichbaren Bandenmuster führte. Anhand dieser Bandenmuster suchten die Autoren nach Unterschieden zwischen BSE-infizierten und nicht infizierten Rindern. Hierfür verwendeten sie CNA aus dem Blutserum von vier normalen Rindern und zwei BSE-positiv diagnostizierten Rindern. Nur oder besonders stark aus den CNA der BSE-Rinder mittels PCR amplifizierte DNA-Fragmente wurden offenbar unkloniert sequenziert, um spezifischere Primer davon abzuleiten. Diese testeten die Autoren in allen Kombinationen und fanden so das geeigneteste Primer-Paar für die Unterscheidung zwischen den infizierten und den anscheinend nicht infizierten Rindern. Die Reaktionsbedingungen während 30 Amplifikationszyklen der Diagnostik-PCR waren: Hybridisierung der Primer an die Nukleinsäure-Einzelstränge bei 55°C für 45 Sekunden, Polymerasereaktion zur Gegenstrangsynthese bei 68°C für 1 Minute und Doppelstrangdenaturierung bei 95°C für 30 Sekunden.

In der Sektion Material und Methoden beschreiben die Autoren, wie sie mit dem am besten differenzierenden Primer-Paar (CHX-1F/CHX-1R) selektiv bestimmte Sequenzen in den CNA von BSE-infizierten und anscheinend nicht infizierten Kontrollrindern amplifizierten und die so gewonnenen DNA-Fragmente nebeneinander durch ein Polyacrylamidgel laufen ließen. Die Kohortentiere bleiben dabei seltsamerweise unerwähnt.

Die bei BSE-positiven und Kontrollrindern besonders unterschiedlich ausgeprägten Banden wurden aus dem Gel geschnitten. Zur Charakterisierung der mit Hilfe der Diagnose-Primer PCR-vermehrten Nukleinsäuren wurden die doppelsträngigen DNA-Fragmente in Plasmide (pGEM-4Z) hinein kloniert, damit sie mit diesen in Bakterien (E.coli) zu großen Mengen vermehrt werden und anschließend sequenziert werden konnten. Dabei interessierten sich die Autoren nur für Sequenzen, die bei mindestens zwei unabhängigen Serumproben amplifiziert wurden. Die Reaktionsbedingungen während 30-35 Amplifikationszyklen waren: Hybridisierung bei 48-55°C für 60 Sekunden, Polymerasereaktion zur Gegenstrangsynthese bei 68°C für 2 Minuten und Doppelstrangdenaturierung bei 94°C für 1 Minute.

Zur Charakterisierung der PCR-Produkte muß man die DNA-Fragmente aber nicht unbedingt sequenzieren. Oft genügt es, nach dem letzten PCR-Amplifikationszyklus die charakteristische Kurve der mit -1 multiplizierten ersten Ableitung der Abnahme der Menge fluoreszenzmarkierter DNA-Doppelstränge während des Aufschmelzens bei steigender Temperatur zu ermitteln. Die Autoren benutzten dazu das MX4000-PCR-System von Stratagene, welches den PCR-Heizblock mit einem eingebautem Fluoreszenzmessgerät kombiniert. In die Reaktionsgefäße für die PCR mischten sie den Farbstoff SYBR Green I, der 1000-fach stärker fluoresziert, wenn er an die kleine Grube doppelsträgiger DNA gebunden ist. So konnten sie während der PCR-Reaktion messen, wie sich DNA-Doppelstränge bildeten und wieder auftrennten. Nach dem letzten Zyklus senkt das Gerät die Temperatur auf 55°C, damit die gebildeten DNA-Fragmente Doppelstränge bilden und den Farbstoff binden können. Nach 30 Sekunden erhöht es die Temperatur langsam wieder bis auf 95°C und misst dabei die Abnahme der Fluoreszenz. Die Software des Gerätes berechnet aus den Meßwerten die negative Ableitung der Fluorszenzabnahme und liefert so ein typisches Kurvenmaximum (Peak) um den spezifischen Schmelzpunkt des Hauptamplifikationsproduktes. Dieser Peak der negativen ersten Ableitung entspricht in der eigentlichen Schmelzkurve einer Beschleunigung der Abnahme der Fluoreszenz aufgrund des beschleunigten Aufschmelzens eines in vielen Kopien vorliegenden DNA-Fragmentes bei Erreichen seiner Schmelztemperatur.

Das die TSE-Forschung ein massiv interdisziplinäres Arbeitsfeld ist und deshalb nur die wenigsten Leser über dieses Gerät und dessen Handbücher verfügen, kümmerte die Autoren leider nicht. Ihre kümmerliche Beschreibung zur Ermittlung ihrer Kurven wird erst verständlich, wenn sich der geneigte Leser die notwendigen Informationen im Internet mühsam selbst beschafft.

In einem gewissen Widerspruch zur Sektion Material und Methoden beschreiben die Autoren unter Resultate, daß sie die CNA von normalen Kontrollrindern, Kohortentieren mit negativen BSE-Testergebnissen und eindeutig festgestellten BSE-Fällen mit dem Diagnose-Primer-Paar (CHX-1F/CHX-1R) einer PCR unterzogen. Sie zeigen anhand eines Polyacrylamidgels und mit einer graphischen Darstellung der ersten Ableitungen der Schmelzkurven der PCR-Produkte, daß die PCR mit diesem speziellen Primerpaar bei den CNA aus normalen Kontrollrindern aus Herden ohne aktenkundigen BSE-Fall zu praktisch keiner Amplifikation führte, während bei den beiden untersuchten BSE-Fällen und bei 4 auf dem Gel sowie in der Graphik gezeigten Kohortentier-CNA jeweils eine ganze Schar unterschiedlich langer DNA-Fragmente entstand. In der PCR sollen aus den CNA bei verhältnismäßig vielen laut BSE-Schnelltest negativen Rindern aus den Fütterungskohorten von BSE-Fällen DNA-Fragmentgemische amplifiziert werden, deren Schmelzprofile relativ ähnlich aussehen. Es dürfte allerdings kaum ein Leser beurteilen können, ob die von den Autoren graphisch dargestellte Ähnlichkeit tatsächlich signifikant ist. Ich finde die Ähnlichkeiten zwischen den gezeigten Bandenmustern und Kurven von BSE-Fällen und Kohortentieren nicht sehr überzeugend und sehe den Unterschied zu den Kontrolltieren eher darin, daß das Diagnose-Primer-Paar bei den Kontrolltieren gar nichts amplifizierte. Das erkennt man aber auch schon am Bandenmuster nach der Gelelektrophorese.

Die PCR-Amplifikationsprodukte der beiden BSE-Fälle und von 6 Kohortentieren wurden sequenziert. Von 163 nach PCR-Selektion mit dem Diagnose-Primer-Paar klonierten DNA-Fragmenten enthielten 150 einen jeweils rund 80 (52-87) Basenpaare langen Bereich mit relativ hoher Homologie zur 3'-Region eines SINE namens Bov-tA, welches homolog zum Primer CHX-1R ist. Die 163 Klone enthielten nur 21 verschiedene Fragmente, von denen 19 die Bov-tA-Homologie enthielten. Bov-tA ist ein evolutionär sehr altes und daher besonders variables Glycin-tRNA-Pseudogen mit 73 Basenpaaren des Glycin-tRNA-Gens am 5'-Ende, 115 Basenpaaren einer nicht wiederholten Sequenz in der Mitte sowie einer kurzen repetitiven Sequenz mit nur 2-6 Basenpaare langen Elementen. Bov-tA kommt in rund 285.000 Kopien, häufig in den 3'-nichttranslatierten Regionen von Genen im Rinder-Genom vor und macht insgesamt etwa 1,6% von ihm aus. Von diesem wurde der Primer CHX-1R abgeleitet. Insgesamt waren die Fragmente 105-304 Basenpaare lang, im Durchschnitt waren es 210 Basenpaare. Die PCR-Produkte bestanden also nicht nur aus den rund 80 Basenpaaren mit der Bov-tA-Homologie, sondern an deren 3'-Enden folgten jeweils mehrere Kopien kurzer Sequenzen (11-20 Basenpaare), in beiderlei Orientierungen. In feinstem Laborslang und natürlich wieder ohne jede Erklärung nennen die Autoren das plus/plus- bzw. plus/minus-Homologien. Die durch Sequenzierung ermittelten CNA-Sequenzen kann man nach Meinung der Autoren so nicht im Rinder-Genom finden. Sie sollen aus verschiedenen Fragmenten zusammengesetzte Chimere sein. Immerhin bestätigt die Sequenzierung, daß die Bandenmuster in den Gelen und auch die Schmelzpunktprofile gar nicht allzu ähnlich sein konnten. Konstant war nur die Tatsache, daß die CNA der beiden BSE-Rinder und eines Teils der Kohortentiere ein bestimmtes SINE enthielten, welches man bei einer nicht allzu großen Anzahl normaler Kontrollrinder nicht fand.

In einer zweiten Runde benutzten die Autoren ihr Diagnose-Primer-Paar (CHX-1F/CHX-1R) für die selektive PCR-Amplifikation von CNA aus 4 bestätigten BSE-Fällen, 135 negativ getesteten Kohortentieren aus 8 Herden mit je einem BSE-Fall sowie 176 Kontrollrindern ohne Hinweis auf eine mögliche BSE-Infektion. Man erhielt PCR-Produkte bei allen vier BSE-Rindern, aber nur bei einem einzigen der 176 Kontrolltiere. Es könnte durchaus sein, daß dieses Kontrolltier BSE-infiziert war, obwohl der BSE-Schnelltest keine BSE-Infektion erkennen konnte. Vor dem Hintergrund bisheriger Untersuchungen der Fütterungskohorten deutscher BSE-Rinder wirklich überraschend war aber die Feststellung der Autoren, daß insgesamt ungefähr 63% der untersuchten Kohortentiere in diesem PCR-Bluttest ähnlich reaktiv wie die BSE-Fälle waren. Dabei schwankte je nach Kohorte der Anteil der reaktiven Rinder zwischen 33 und 91%.

In einer Feldstudie nahmen die Autoren zusätzlich noch 669 Serumproben von Schlachtrindern, welche von 257 norddeutschen Höfen stammten und hinsichtlich ihrer Altersverteilung den Kohortentieren entsprachen. Zum Vergleich untersuchten sie neben diesen 669 unverdächtigen Proben auch noch einmal Seren von Kohortentieren. Mit ihrem Diagnose-Primer-Paar reagierten in der PCR diesmal 58% der Kohorten-CNA, aber nur bei 4 (0,59%) der CNA aus den Seren der 669 scheinbar gesund geschlachteten Rinder reagierten ebenfalls. Dies bedeutet keineswegs, daß diese Methode wegen eines mit 0,59% unakzeptabel hohen Anteils falsch positiver Resultate ungeeignet für ein BSE-Screening wäre. Es ist nämlich gut möglich, daß diese vier normal geschlachteten Rinder BSE-infiziert waren, obwohl sie von den BSE-Schnelltests nicht als solche erkannt wurden.

Selbstverständlich konnten die Autoren für das bisher am besten funktionierende Primer-Paar (CHX-1F/CHX-1R) noch nicht PCR-Muster für sämtliche Rinderkrankheiten erstellen. Die tatsächliche Spezifität dieser Primer bzw. der gesamten Methode für die Erkennung BSE-infizierter Rinder müsste daher noch ermittelt werden. Die Autoren erklären auch selber, daß die verstärkte Transkription von SINE-Elementen eine Streßreaktion insbesondere von Nervenzellen sei. Demnach wäre gar nicht zu erwarten, daß man sie ausschließlich bei BSE-infizierten Rindern findet. Offenbar konnte man bisher nicht einmal feststellen, ob ein BSE-spezifisches Bandenmuster nur eine beginnende BSE-Erkrankung, auch subklinische BSE-Infektionen, oder vielleicht sogar durch Abbau und Ausscheidung aufgenommener Prionen bereits überwundene BSE-Infektionen bzw. Kontaminationen anzeigt. Es wäre sogar denkbar, daß die Methode "nur" eine gewisse Empfänglichkeit für BSE-Infektionen anzeigt. Die Autoren meinen, die Häufigkeit der Bov-tA-Reaktivität in Kohortentieren spreche dafür, daß diese Infektiosität aufgenommen haben und sich mit dieser unter Zellstreß auseinander setzen, auch wenn sie erst sehr viel später oder schließlich gar nicht erkranken. Denkbar ist das, denn selbst intrazerebral inokulierte Infektiosität nimmt bekanntlich zunächst bis auf kaum noch meßbare Konzentrationen ab, wird also vom Organismus großenteils ausgeschieden und vermutlich auch enzymatisch abgebaut. Erstaunlich ist aber, daß man diese wichtige Frage nicht mit dem hierfür geeigneten Probenmaterial aus der deutschen Pathogenese-Studie überprüft hat.

Als die erste offizielle Anerkennung eines BSE-Falles bei einem in den USA geborenen Rind erst durch eine vom US-Landwirtschaftsminister nicht autorisierte und deshalb kritisierte Überprüfung im britischen Referenzlabor zustande kam, da wurde von Fachleuten die US-amerikanische Praxis als Vertuschungsstrategie kritisiert, nach der in den USA bis dahin BSE-Fälle nur als solche anerkannt wurden, wenn nach zwei positiven Schnelltestergebnissen auch eine immunhistochemische Untersuchung ein positives Ergebnis ergab. Die Durchführung von Western blots hatten die Verantwortlichen in den USA stets abgelehnt, obwohl aus Japan und Europa längst BSE-Fälle bekannt waren, in denen zwar Schnelltests und der Western blot, nicht aber die Immunhistochemie positive Resultate lieferten. Zumindest in bestimmten Fällen ist die Immunhistochemie eindeutig weniger sensitiv als der OIE-Western blot und der BioRad-Schnelltest. Vor allem aber hängen erfolgreiche BSE-Nachweise bei der besonders aufwändigen und fehleranfälligen Methode der Immunhistochemie sehr stark von der Erfahrung und dem Eifer der Untersucher ab, BSE-Fälle auch tatsächlich als solche zu identifizieren. Das diese Bedingungen in den USA nicht gegeben waren, zeigt der Umstand, daß der erste eigene BSE-Fall der USA zunächst vom eigenen Referenzlabor aufgrund eines negativen immunhistochemischen Ergebnisses als falsch positiv eingestuft wurde, während das britische Referenzlabor mit der selben Methode ein eindeutig positives Resultat erzielte.

Unter Fachleuten war diese Vertuschungsstrategie der US-Administration seit Jahren bekannt und wurde wiederholt kritisiert. Deshalb ist es etwas befremdlich, daß die Autoren behaupten, durch positive Schnelltestergebnisse aufgekommene Verdachtsfälle würden definitionsgemäß durch Immunhistochemie bestätigt. In Wirklichkeit erfolgt ja die Abklärung im deutschen BSE-Referenzlabor immer auch und vor allem mittels OIE-Western blot. Eine Nachfrage ergab aber, daß die Nichterwähnung des Western blots nur eine gewisse Nachlässigkeit in der Definition BSE-positiver Rinder war, weil dieser Punkt im Rahmen dieser Arbeit als nicht wichtig angesehen wurde.

Liste meiner Artikelzusammenfassungen
TSE-Hypertext-Projekt
meine Startseite
Autoren-Index

Kommentare und Kritik von Fachleuten sind jederzeit willkommen.

Copyright Roland Heynkes